INTRODUCTION

La perte de la fonction d’agrégation plaquettaire qui se développe dans les minutes suivant un traumatisme majeur participe au développement d’une coagulopathie aiguë qui accentue le saignement et augmente de manière significative le risque de défaillance multivicérale et de mort.

Bien que les causes de la dysfonction plaquettaire ne soient pas connues, il est suspecté qu’un ou plusieurs facteurs plasmatiques secrétés chez le patient traumatisé puissent en être à l’origine. En ce sens, les protocoles de transfusion massive actuels supportent le rôle fondamental de la transfusion de concentrés plaquettaires bien qu’elle ne permet pas ou peu de restaurer une fonction plaquettaire satisfaisante.

Comprendre la fonction des plaquettes et les mécanismes de leur dysfonction chez les patients qui saignent est donc essentiel pour progresser dans leurs prises en charge.

OBJECTIF DE L’ÉTUDE

Comprendre et définir la nature et les mécanismes à l’origine des changements phénotypiques des plaquettes des patients victimes de traumatismes majeurs.

DESIGN DE L’ÉTUDE

• Patients adultes recrutés dans l’étude ACIT (Activation of Coagulation and Inflammation after Trauma) qui réunissaient les critères d’activation de l’Advanced Trauma Team dans un seul Trauma Center de Londres
• Les échantillons de sang pour analyse étaient obtenus dans les 2 heures suivant le traumatisme et étaient traités directement. Ces prélèvements se rapportaient au groupe « Trauma Patients »
• Les prélèvements chez des volontaires sains, ne prenant aucun traitement, constituaient le groupe « Healthy Volunteers »
• 82 « Trauma Patients »:
  • 84% d’homme
  • 79% de « Blunt Mechanism »
  • ISS (Injury Severity Score) moyen de 29 (maximum du score = 75) avec une majorité de traumatismes thoraciques, du pelvis et des membres
  • 88% des patients présentaient une hypoactivité plaquettaire définie comme une réponse réduite au Multiplate
  • 55% d’hémorragies massives définies comme la nécessité de transfuser plus de 4 concentrés érythrocytaires sur les 24 premières heures
  • 37% de mortalité à 28 jours
• 10 « Healthy Volunteers »

 MATÉRIELS ET MÉTHODES

• Visualisation des plaquettes au microscope à balayage électronique
• Utilisation de la cytométrie de flux pour la quantification, la qualification et la visualisation au niveau des plaquettes de l’expression de la P-selectin (CD62P), de l’activation de l’integrin a_IIbb₃, de la liaison à l’annexin V et de l’Histone H4
• Utilisation de l’imagerie par cytométrie de flux pour la visualisation du ballonnement plaquettaire, de l’interaction plaquettes-leucocytes et des microparticules dérivées des plaquettes (PMPs = platelets-derived microparticles) ainsi quantifiées et caractérisées
• Stimulation plaquettaire après lavage pour permettre l’analyse et la visualisation en cytométrie de flux
• Utilisation du logiciel Morpheus (Broad Institute) pour permettre la Classification Ascendante Hiérarchique et la constitution des différents groupes
• L’analyse statistique a été réalisée en utilisant Prism v6.0 (GraphPad) avec une valeur de p <0.05 pour juger de la significativité des résultats

RÉSULTATS

LA PRODUCTION DE THROMBINE EST MAINTENUE CHEZ LES PATIENTS PRÉSENTANT UNE DYSFONCTION PLAQUETTAIRE MALGRÉ LA PERTE DE FACTEURS PROCOAGULANTS

• La classification ascendante hiérarchique a permis de dégager 4 clusters spécifiques de patients se basant sur des fonctions plaquettaires variables en lien avec des caractéristiques cliniques et des outcomes distincts
  • Pour les clusters C3 et C4, qui regroupent les patients les plus sévèrement « malades » et avec le taux le plus important de coagulopathie traumatique (Fig. 1A et 1B) :
    • L’agrégation plaquettaire était réduite
    • Par contre, la formation de thrombine était très augmentée (Fig. 1C)
  • Cette altération de l’agrégation plaquettaire était associée à :
    • Un besoin de transfusion de concentrés érythrocytaires plus important
    • Une incidence deux fois supérieure de défaillance multivicérale
    • Une incidence dix fois supérieur de la mortalité
  • 1^errésultat : les patients présentant des hémorragies sévères présentent une altération de la fonction d’agrégation plaquettaire mais conservent la capacité à générer de la thrombine

PRÉCISIONS SUR LES « PLATELETS BALLOONS » ET LES MÉCANISMES DE « PLATELTS BALLOONING »

Les plaquettes sont des cellules de surveillance de l’intégrité du système vasculaire, permettant d’en détecter des lésions et d’agir comme le signal précoce et rapide de mise en place du système de réparation. Elles adhèrent rapidement à la matrice de collagène sous-endothéliale, recrutant ainsi plus de plaquettes pour former un agrégat et stabiliser cette structure initiale par le déclenchement des processus de coagulation.

Cette activité procoagulante des plaquettes dépend de l’importance de la surface d’exposition plaquettaire aux aminophospholipides chargés négativement, en particulier la phosphatidylserine (PS) qui se lie aux complexes ténase et prothrombinase. La dynamique de modification membranaire des plaquettes, notamment ce fameux « ballonnement », étaye la coagulation et fait partie de la réponse hémostatique normale au niveau des lésions vasculaires.

 Pour reproduire in vitro le « Platelets Ballooning » ou formation de Plaquettes en forme de Ballon, il est nécessaire de les exposer à de hautes concentrations de collagène et de thrombine, conditions retrouvées in et ex vivo au niveau de lésions endothéliales.

Comme écrit précédemment, ce ballonnement augmente la surface d’exposition de la membrane plaquettaire pour permettre la formation de complexes procoagulants, étape essentielle pour la génération de thrombine au niveau des sites de lésions vasculaires.

 Les histones sont connus pour promouvoir la génération, en lien avec les plaquettes, de thrombine, mais ne sont par contre pas connus pour induire le « ballonnement » plaquettaire.

LES PATIENTS VICTIMES DE TRAUMATISMES AVEC HÉMORRAGIES SÉVÈRES DÉVELOPPENT PRÉCOCÉMENT DES PLAQUETTES PROCOAGULANTE EN FORME DE « BALLON »

• Les auteurs ont identifié le développement de structures en forme de ballon très tôt pendant la réanimation de patients victimes d’hémorragies sévères (flèches rouges)

• Ces structures n’avaient plus d’intégrité membranaire, n’avaient pas de contenu cytoplasmique et n’étaient pas présentes chez les volontaires sains. Les auteurs ont montré que ces structures étaient bien des plaquettes et qu’elles étaient procoagulantes
• La proportion de plaquettes circulantes en forme de ballon augmente avec la gravité des lésions et après la transfusion de concentrés plaquettaires

• Les auteurs ont montré que la membrane plaquettaire étendue par son « ballonnement » permet de l’exposer de manière plus importante à la phosphatidylserine (PS). Ainsi, des complexes d’enzymes procoagulantes se forment à la surface permettant la génération de thrombine
• 2^èmerésultat : il existe un processus de « ballonnement » des membranes plaquettaires chez les patients traumatisés graves, jamais encore identifié ex vivo, survenant d’autant plus que les lésions vasculaires sont importantes.

LA FORMATION DE « BALLONS » EST ASSOCIÉ AU RELARGAGE PAR CES PLAQUETTES « MODIFIÉES » DE MICROPARTICULES RECOUVRANT LES LEUCOCYTES CIRCULANTS

• Les « Platelets Balloons » ont une paroi membranaires friables, pouvant se désagréger, conduisant à la libération de microparticules. Les taux plasmatiques de ces microparticules, nommées « platelet-derived microparticles » (PMPs), sont connus pour être élevés à la phase initiale d’un traumatisme grave. Les auteurs ont montré grâce à l’imagerie couplée à la cytométrie de flux que les leucocytes circulants des patients traumatisés étaient recouverts par ces PMPs et ce d’autant plus que le nombre de « Platelets Balloons » était important.

• La proportion de ces leucocytes circulants ainsi recouvert était également d’autant plus importante que le traumatisme initial était grave.

• Les patients traumatisés développaient d’autant plus de défaillances multivicérales que leurs leucocytes circulants étaient recouverts de PMPs

• Les histones sont des DAMPs (« Damage-Associated Molecular Patterns »), relargués par les cellules endomagées dans la circulation en grande quantité après un traumatisme sévère, affectant la fonction plaquettaire et leurs membranes
• Hypothèse des auteurs : ces histones seraient donc les éléments directement responsables de la formation des « Platelets Balloons » et du relargage de microparticules dans la coagulopathie traumatique. Ils se concentrent sur les histones H4 spécifiquement puisque ce sont eux qui sont connus pour avoir la plus grande action sur les plaquettes et les membranes cellulaires donc plaquettaires en comparaison des autres histones.

LES HISTONES H4 SONT CYTOTOXIQUES POUR LES PLAQUETTES, INDUISANT UNE ÉLÉVATION PÉRENNE DU CALCIUM CYTOSOLIQUE ET AINSI UNE DIMINUTION DE L’ACTIVATION PLAQUETTAITE AUX STIMULATIONS

• L’histone H4 était détectable à la surface des plaquettes des patients traumatisés graves

• In vitro, l’exposition de plaquettes de volontaires sains à de l’histone H4, aux mêmes concentrations que celles rencontrées chez les patients traumatisés graves, entrainait une augmentation du calcium cytosolique de ces plaquettes pendant une durée d’au moins 60 minutes avec une diminution de leur réponse aux stimuli d’activation

• 3^èmerésultat : l’histone H4 a une action directe sur les plaquettes réduisant la réponse aux stimuli d’activation

LA PRÉSENCE D’HISTONE H4 EN EXTRACELLULAIRE INDUIT LE BALLONNEMENT PLAQUETTAIRE ET LA PRODUCTION DE MICROPARTICULES

• L’augmentation de la concentration intracellulaire de calcium est une condition nécessaire pour la formation de « ballons »
• Les plaquettes des volontaires sains exposées à l’histone H4 se transformaient rapidement en plaquettes en forme de « ballon », avec la persistance de l’histone H4 sur ce qui restait de la membrane ainsi modifiée des « ballons » mais également en périphérie de ces « ballons »
• Ces même histones H4 étaient retrouvés à la surface des plaquettes en forme de « ballons » chez les patients traumatisés

• Les plaquettes des volontaires sains exposées à l’histone H4 in vitro entrainait une augmentation concentration-dépendante de l’expression d’histones à la surface des plaquettes, la transformation en plaquettes « procoagulantes » et la transformation en « Platelets Balloons »

• Les plaquettes « traitées » à l’histone H4 produisaient également une grande quantité de microparticules à l’origine du maintien de ces histones à leurs surfaces et exprimaient de la PS également à leurs surfaces

• L’histone H4 entraîne un relargage concentration-dépendant de PF4 (proinflammatory alpha granule protein platelet factor 4) de la part des plaquettes in vitro, faisant ainsi écho aux taux plasmatiques élevés de PF4 observés chez les patients traumatisés graves

DISCUSSION ET CONCLUSION DE L’ÉTUDE

• Les auteurs mettent en évidence dans cette étude les intéractions in vivo entre l’histone H4 et les plaquettes après un traumatisme grave à l’origine d’une augmentation pérenne de leur calcium intracellulaire entrainant « ballonnement » et transformation en vecteur de la coagulation
• L’histone H4 provient des tissus qui ont été endommagés « mécaniquement » par le traumatisme initial et l’hémorragie qui peut en découler
• Des 5 familles d’histones connues, les H4 sont ceux qui ont le plus d’actions sur les plaquettes et qui déclenchent les transformations membranaires, dont la formation de « ballons »
• La mise en évidence de cette intéraction pourrait apporter des réponses aux phénomènes procoagulants survenant dans des situations de relargage d’histones sans exposition à du collagène comme en cas de syndrome de reperfusion après une ischémie ou encore de la CIVD rencontrée dans le sepsis
• De par leur structure fragile et très friables, les « Platelets Balloons » se désagrègent facilement entrainant la libération de microparticules recouvrant alors les leucocytes circulants et pouvant expliquer le lien entre activation de la coagulation et inflammation aigue et le développement de défaillance multivicérale, d’autant plus fréquemment que le traumatisme initial est sévère
• Implications sur le management des hémorragies traumatiques et sur la compréhension de la coagulopathie traumatique :
  • Éléments de réponse pour expliquer la génération importante de thrombine dans un contexte de perte de facteurs de coagulation chez les patients traumatisés sévères. La transformation des plaquettes en « ballons procoagulants » pourrait en être la raison
  • Le changement de comportement des plaquettes dans un contexte de traumatisme est certainement beaucoup plus complexe que seulement une dysfonction de l’agrégation plaquettaire. Il est encore peu clair comment les « Platelets Balloons » et les PMPs modifient les examens biologiques standards de l’hémostase ainsi que le TEG et ROTEM
  • Bien que la transfusion de concentrés plaquettaires tienne une place importante dans les protocoles d’hémorragie massive pour limiter la dysfonction plaquettaire, il reste beaucoup d’incertitude sur leur efficacité et sur leurs mécanismes d’action. En effet, ces plaquettes allogéniques sont exposées aux mêmes conditions que les plaquettes endogènes et sont donc également susceptibles d’être transformées en « ballons procoagulants » par les histones, notamment H4. Ceci apporte une explication, possible, au fait que les plaquettes permettent de réduire la fibrinolyse sans permettre la restauration de la fonction d’agrégation plaquettaire.

CE QU’EN PENSE BLOCKCHOC 

RAPPEL

Il nous semble nécessaire de faire un point rapide pour savoir de quoi l’on parle lorsqu’on énonce une dysfonction plaquettaire et pour ainsi comprendre cet article.

L’hémostase se compose de 3 temps distincts et successifs :

• L’hémostase primaire
• La coagulation
• La fibrinolyse

 L’hémostase primaire et la coagulation sont très intriquées et surviennent de manière quasiment contemporaine. Les plaquettes, éléments essentiels de ces deux premières phases, sont des cellules anucléées riches en organelles cytoplasmiques et en granules de sécrétion contenant de l’ADP, des facteurs de coagulation, du facteur de von Willbrand (vWF), du fibrinogène et des facteurs de croissance. Elles vont adhérer à la brèche vasculaire, s’activent, secrètent leur contenu granulaire, émettent des pseudopodes qui forment un entrelacs qui emprisonnent les éléments figurés du sang et, enfin, elles s’agrègent les unes aux autres.

 Les plaquettes adhèrent à la paroi vasculaire par l’intermédiaire du vWF. Le vWF est une protéine d’adhésion soluble plasmatique, qui sert de « colle moléculaire » entre le collagène sous-endothélial et les plaquettes par l’intermédiaire de leurs récepteurs membranaires spécifiques, la glycoprotéine Ib (Gp1b).

L’activation plaquettaire se fait par l’intermédiaire de la stimulation des nombreux récepteurs à leur surface :

• Pour des agonistes solubles (ADP, Thrombine, Thromboxane A2, sérotonine),
• Pour des protéines d’adhésion, solubles ou matricielles (collagène, fibrinogène, vWF).

Ainsi activées, les plaquettes changent de forme et secrètent leur contenu granulaire.

L’agrégation plaquettaire est le résultat de l’activation plaquettaire, médiée par le Fibrinogène, ligand de l’intégrinea_IIbb₃ présente sur leur membrane.

• Lorsque la plaquette est activée, l’intégrine a_IIbb₃ subit un changement de conformation qui rend accessible le site de liaison au fibrinogène

• Le fibrinogène, molécule symétrique de taille suffisante sert alors de pont entre les plaquettes

Par la suite, la coagulation permettra la consolidation de l’agrégat nouvellement formé au cours de l’hémostase primaire par un réseau de Fibrine avec la rétractation du clou plaquettaire.

Une fois ces points rappelés, il devient évident que la modification structurelle membranaire des plaquettes en « ballon » par l’histone H4 va, au niveau de l’hémostase primaire, empêcher et entraver l’agrégation plaquettaire, comme mis en évidence dans cette étude.

Il s’agit donc d’une dysfonction de l’agrégation plaquettaire, constitutive avec d’autres entités, de la dysfonction plaquettaire.

DES CONCEPTIONS DIFFÉRENTES DE LA COAGULOPATHIE TRAUMATIQUE QUI CONVERGENT

Il faut noter que Brohi, dernier auteur de cette étude défend une définition physiopathologique particulière de la coagulopathie traumatique. Sa vision est bien décrite dans une publication du MAPAR de 2013 de Figueiredo de l’équipe du Kremlin Bicêtre.

Pour Brohi et al., les 2 facteurs à l’origine de la coagulopathie sont le traumatisme tissulaire et l’hypoperfusion systémique. La coagulopathie est donc caractérisée par une anticoagulation systémique et une hyperfibrinolyse. Elle serait médiée par l’activation de la Protéine C, un inhibiteur physiologique de la coagulation. Pour ces auteurs, les facteurs de coagulation sont peu diminués mais inhibés par la protéine C (facteur VIIIa et Va) entraînant une augmentation du tPA, puissant fibrinolytique.

À l’inverse, pour Gando et al., la coagulopathie traumatique ne constitue pas une nouvelle entité : il s’agit « simplement » d’un exemple de CIVD avec un phénotype fibrinolytique et consommation des facteurs procoagulants. Pour ces auteurs, les lésions tissulaires et la libération de cytokines proinflammatoires secondaires au traumatisme entraînent une libération importante de Facteur Tissulaire avec génération massive de thrombine. L’inflammation est, de plus, responsable d’une diminution des inhibiteurs physiologiques de la coagulation aboutissant à une extension systémique du processus de coagulation, à une consommation de facteurs de coagulation et à une hyperfibrinolyse pouvant devenir incontrôlables.

Pour Brohi et al. la coagulopathie traumatique est une nouvelle entité de trouble de la coagulation, en ce sens qu’il faut la coexistence du dommage tissulaire et de l’hypoperfusion pour qu’elle survienne. Les lésions tissulaires libèrent des DAMPs, dont font partie les histones H4, engrangeant ainsi la formation de ballons certes procoagulants mais qui gênent l’agrégation plaquettaire, première étape de l’hémostase globale.

Mais la mise en évidence de la libération des microparticules venant recouvrir les leucocytes circulants et ainsi favoriser l’inflammation rejoint l’approche de Gando et al..

CONCLUSION

Cette étude n’apporte pas directement des réponses aux cliniciens quant à la stratégie transfusionnelle. Maintenant elle renforce l’idée de la nécessité de considérer les différents éléments que l’on transfuse comme un tout défendant la notion d’une hémostase non linéaire avec le besoin de considérer les différents éléments qui participent à l’hémostase globale comme interagissant en permanence entre eux (facteurs de coagulation, plaquettes, fibrinogène).